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原子吸收分光光度法檢測(cè)蔬果中維生素C含量
點(diǎn)擊: 次 時(shí)間:2017-03-08 10:27
維生素C又叫抗壞血酸(Ascorbicid)，廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜中含量較多。是一種水溶性小分子生物活性物質(zhì)，也是人體需要量最大的一種維生素。維生素C具有還原性(其結(jié)構(gòu)式如圖1)，可以與許多氧化劑發(fā)生氧化還原反應(yīng)，因此可以利用其還原性測(cè)定維生素C的含量。目前食品中測(cè)定維生素C含量的方法主要有碘量法，是利用維生素C的氧化還原性為基礎(chǔ)的一種氧化還原方法。岡其酸度不易把握，碘需要標(biāo)定且易揮發(fā)，而Vc不易穩(wěn)定保存，使測(cè)定結(jié)果易出現(xiàn)偏差，且這種方法不適合微量分析;國標(biāo)GB/T6195-1986是采用2，6一二氯靛酚滴定法。利用樣品溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色來辨別其滴定終點(diǎn)的到達(dá)。但是多數(shù)水果、蔬菜樣品其提取液都具有一定的色澤而導(dǎo)致滴定終點(diǎn)不明顯，使測(cè)定準(zhǔn)確度降低。另外還有熒光光譜分析法 J、紫外一可見分光度法、色譜法、電化學(xué)法等，這些方法都存在著一定的局限性，如操作過程復(fù)雜，所用試劑不穩(wěn)定，速度慢、背景¨干擾大。近年來，建立的測(cè)定Vc的其他方法還有催化動(dòng)力學(xué)和光度法相結(jié)合的方法，及VC傳感器測(cè)定方法，固定pH滴定法等。
該論文將對(duì)蔬菜、水果常用的維生素C含量的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述、比較。
1原子吸收分光光度法
利用原子吸收分光光度法問接測(cè)定維生素C的含量，是利用維生素C可以與一些金屬離子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，通過測(cè)定反應(yīng)掉的金屬離子的量，進(jìn)而間接計(jì)算出維生素c的含量。
1.1以銀離子作為氧化劑的間接原子吸收分光光度法
以銀離子作為氧化劑的間接原子吸收分光光度法，是利用維生素C分子中的有二烯醇基具強(qiáng)還原性，可被硝酸銀氧化為去氫維生素C，同時(shí)產(chǎn)生黑色銀沉淀(反應(yīng)式如圖2)。
沉淀經(jīng)離心分離后，將分離得到的沉淀用硝酸溶解后，再利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定銀離子的含量，從而接測(cè)得維生素C含量，具體測(cè)定方法如下：
配制一系列濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次吸取一定量的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10mL離心管中，分別加入2mL(1mg/mL) Ag 標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加水使總體積為4mL，搖勻，在室溫下避光放置35min離心分離棄去上清液，用2mL超純水洗滌沉淀3次，然后用l:1的濃硝酸3mL溶解沉淀，移入50mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度。噴入空氣-乙炔火焰分別測(cè)定其吸光度，以維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后將處理過的待測(cè)樣按上述方法測(cè)定其維生素C含量。
上述方法巾維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的配制都是利用2%的檸檬酸作為溶劑，并在棕色瓶中保存，原因是維生素C在溶液中不穩(wěn)定，遇氧氣、光、熱、堿性物質(zhì)易受破壞，而在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下比較穩(wěn)定，用2%的檸檬酸溶液來配制維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，減緩了維生素C被氧化的速度，同時(shí)消除了一定外界因素的十?dāng)_，使得測(cè)定結(jié)果比較穩(wěn)定。
1.2 以銅離子作為氧化劑的間接原子吸收分光光度法
文獻(xiàn)中報(bào)道了以銅離子作為氧化劑的間接原子吸收分光光度法。該方法也是利用維生素C在酸性介質(zhì)中維生素C可將Cu2 定量的還原為Cu ，然后Cu 與SCN-反應(yīng)生成CuSCN沉淀，在高速離心機(jī)下有效地分離出CuSCN沉淀，洗滌后再經(jīng)濃硝酸溶解，用原子吸收法測(cè)定沉淀中的含銅量，即可推知樣品中維生素C的含量。具體測(cè)定方法如下：
分別吸取1mL配制的含一定量維生素C的標(biāo)準(zhǔn)溶液(隨配隨用)(分別含維生素C 50、100、200、300、400、500 µg)和樣品提取液，依次放置于已編號(hào)的15mL離心管中，各加入1mLCuSO4飽和溶液、1mL濃度為2%硫氰酸銨溶液、0.5mL鹽酸-醋酸鈉緩沖液和0.5 mL飽和NaCl溶液充分混和，稍后離心分離，棄去上層清液，小心地用少量水洗滌沉淀2～3次(注意每次用水不能超過1 mL)，加入0.5mL硝酸溶解后，轉(zhuǎn)移至lO0mL的容量瓶中加水定容至刻度線，搖勻。分別用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定其含銅量，由所得的維生素C含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得到相應(yīng)樣品的試驗(yàn)結(jié)果。
該方法所得的試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在5%以內(nèi)加標(biāo)回收率在96.56%～100.67%，其精密度和準(zhǔn)確度均達(dá)到痕量分析要求。此方法的線性相關(guān)系數(shù)R=O 9989，表明相關(guān)性很好。
2紫外可見分光光度法
利用紫外分光光度法測(cè)定維生素C的含量是基于維生素c在紫外光區(qū)有特征吸收，但是因?yàn)榫S生素C結(jié)構(gòu)中具有不飽和鍵，具有還原性，不易穩(wěn)定存在，直接測(cè)定誤差較大。所以在利用紫外分光光度法測(cè)定時(shí)，維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣的配制條件非常重要。曾國富，黃玉英研究發(fā)現(xiàn)，維生索C在CTAB-C5H11OH-H2O微乳液體系中非常穩(wěn)定，它存在于微乳液滴膜的內(nèi)側(cè)，與滲透進(jìn)入液滴膜外側(cè)的溶液氧接觸的機(jī)會(huì)極少，該體系能極大地提高維生素C的穩(wěn)定性。
鄭京平等利用維生素C具有對(duì)紫外產(chǎn)生吸收和對(duì)堿穩(wěn)定的特性，建立了紫外分光光度快速測(cè)定水果、蔬菜維生素c的新方法。根據(jù)維生素C具有對(duì)紫外產(chǎn)生吸收和對(duì)堿不穩(wěn)定的特性，于波長243nm處測(cè)定樣品溶液與堿處理樣品兩者吸光度之差，通過查校準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算樣品巾維生素C的含量。此法操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，結(jié)果令人滿意。特別適合含深色樣品的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，檢出限低，可快速測(cè)定水果、蔬菜中維生素C，值得推廣應(yīng)用。
張立科等介紹了在0～450µg/mL線性范圍內(nèi)，以cu2 作催化劑，以溶解氧將還原型維生素C氧化為在246.0 nm處無吸收的氧化型Vc，實(shí)現(xiàn)了樣品各紫外干擾成分的本底校正，建立了種測(cè)定果蔬Vc的新方法。該方法中維生素C破壞條件的選擇尤為重要，確定條件為：Cu用量為30 g，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為20min，加熱條件下，反應(yīng)速度快，無需加掩蔽劑。方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，測(cè)定了香蕉、西紅柿等果蔬中的VC含量，結(jié)果令人滿意。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)得出該方法RsD在0.32%～0.89%之間，實(shí)際測(cè)定了香蕉、西紅柿等樣品中的VC的含量，檢出限為0.2791g/mL，加標(biāo)回收率在97.16%～100.18%之間 。
3高效液相色譜法
前面介紹的方法由于在使用中有一定的限制，操作復(fù)雜、前處理較麻煩。因此在使用中有較大的局限性，目的已逐漸被高效液相色譜法所取代。HPLC法具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠等特點(diǎn)。
王艷穎，姜國斌等采用HYPERSIL-C8fz譜柱、濃度0.1%的草酸作流動(dòng)相的高效液相色譜法，分析了草莓中的維生素c含量，取得了理想的效果。HPLC檢測(cè)條件如下：
流動(dòng)相0.1%草酸溶液，流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣量5µL，柱箱溫度3O℃。該方法分析中受樣品中其他雜質(zhì)的影響較小。測(cè)定草莓中維生素C的含量，回收率為97.4%～102.1%，說明該方法具有所需試劑少、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，說明該方法重復(fù)性和再現(xiàn)性都是比較高的。
陳昌云等采用0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液：甲醇=80:20(v/v)作流動(dòng)相。流速為1.0 mL/min，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長為254 nm。測(cè)定蜜柚中維生素C含量在質(zhì)量濃度為20～100mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，方法回收率為92.4%～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。
4 結(jié)語
測(cè)定維生素C含量方法很多，各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，因?yàn)榫S生素C自身的不穩(wěn)定，導(dǎo)致了很多方法測(cè)定結(jié)果誤差較大，所以對(duì)維生素C穩(wěn)定存在條件的探索非常重要。高效液相色譜法因?yàn)闇y(cè)定較準(zhǔn)確、靈敏度高、選擇性好，有較好的發(fā)展前景，是目前發(fā)展較快的一種方法。
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該論文將對(duì)蔬菜、水果常用的維生素C含量的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述、比較。
1原子吸收分光光度法
利用原子吸收分光光度法問接測(cè)定維生素C的含量，是利用維生素C可以與一些金屬離子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，通過測(cè)定反應(yīng)掉的金屬離子的量，進(jìn)而間接計(jì)算出維生素c的含量。
1.1以銀離子作為氧化劑的間接原子吸收分光光度法
以銀離子作為氧化劑的間接原子吸收分光光度法，是利用維生素C分子中的有二烯醇基具強(qiáng)還原性，可被硝酸銀氧化為去氫維生素C，同時(shí)產(chǎn)生黑色銀沉淀(反應(yīng)式如圖2)。
沉淀經(jīng)離心分離后，將分離得到的沉淀用硝酸溶解后，再利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定銀離子的含量，從而接測(cè)得維生素C含量，具體測(cè)定方法如下：
配制一系列濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次吸取一定量的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10mL離心管中，分別加入2mL(1mg/mL) Ag 標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加水使總體積為4mL，搖勻，在室溫下避光放置35min離心分離棄去上清液，用2mL超純水洗滌沉淀3次，然后用l:1的濃硝酸3mL溶解沉淀，移入50mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度。噴入空氣-乙炔火焰分別測(cè)定其吸光度，以維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后將處理過的待測(cè)樣按上述方法測(cè)定其維生素C含量。
上述方法巾維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的配制都是利用2%的檸檬酸作為溶劑，并在棕色瓶中保存，原因是維生素C在溶液中不穩(wěn)定，遇氧氣、光、熱、堿性物質(zhì)易受破壞，而在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下比較穩(wěn)定，用2%的檸檬酸溶液來配制維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，減緩了維生素C被氧化的速度，同時(shí)消除了一定外界因素的十?dāng)_，使得測(cè)定結(jié)果比較穩(wěn)定。
1.2 以銅離子作為氧化劑的間接原子吸收分光光度法
文獻(xiàn)中報(bào)道了以銅離子作為氧化劑的間接原子吸收分光光度法。該方法也是利用維生素C在酸性介質(zhì)中維生素C可將Cu2 定量的還原為Cu ，然后Cu 與SCN-反應(yīng)生成CuSCN沉淀，在高速離心機(jī)下有效地分離出CuSCN沉淀，洗滌后再經(jīng)濃硝酸溶解，用原子吸收法測(cè)定沉淀中的含銅量，即可推知樣品中維生素C的含量。具體測(cè)定方法如下：
分別吸取1mL配制的含一定量維生素C的標(biāo)準(zhǔn)溶液(隨配隨用)(分別含維生素C 50、100、200、300、400、500 µg)和樣品提取液，依次放置于已編號(hào)的15mL離心管中，各加入1mLCuSO4飽和溶液、1mL濃度為2%硫氰酸銨溶液、0.5mL鹽酸-醋酸鈉緩沖液和0.5 mL飽和NaCl溶液充分混和，稍后離心分離，棄去上層清液，小心地用少量水洗滌沉淀2～3次(注意每次用水不能超過1 mL)，加入0.5mL硝酸溶解后，轉(zhuǎn)移至lO0mL的容量瓶中加水定容至刻度線，搖勻。分別用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定其含銅量，由所得的維生素C含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得到相應(yīng)樣品的試驗(yàn)結(jié)果。
該方法所得的試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在5%以內(nèi)加標(biāo)回收率在96.56%～100.67%，其精密度和準(zhǔn)確度均達(dá)到痕量分析要求。此方法的線性相關(guān)系數(shù)R=O 9989，表明相關(guān)性很好。
2紫外可見分光光度法
利用紫外分光光度法測(cè)定維生素C的含量是基于維生素c在紫外光區(qū)有特征吸收，但是因?yàn)榫S生素C結(jié)構(gòu)中具有不飽和鍵，具有還原性，不易穩(wěn)定存在，直接測(cè)定誤差較大。所以在利用紫外分光光度法測(cè)定時(shí)，維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣的配制條件非常重要。曾國富，黃玉英研究發(fā)現(xiàn)，維生索C在CTAB-C5H11OH-H2O微乳液體系中非常穩(wěn)定，它存在于微乳液滴膜的內(nèi)側(cè)，與滲透進(jìn)入液滴膜外側(cè)的溶液氧接觸的機(jī)會(huì)極少，該體系能極大地提高維生素C的穩(wěn)定性。
鄭京平等利用維生素C具有對(duì)紫外產(chǎn)生吸收和對(duì)堿穩(wěn)定的特性，建立了紫外分光光度快速測(cè)定水果、蔬菜維生素c的新方法。根據(jù)維生素C具有對(duì)紫外產(chǎn)生吸收和對(duì)堿不穩(wěn)定的特性，于波長243nm處測(cè)定樣品溶液與堿處理樣品兩者吸光度之差，通過查校準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算樣品巾維生素C的含量。此法操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，結(jié)果令人滿意。特別適合含深色樣品的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，檢出限低，可快速測(cè)定水果、蔬菜中維生素C，值得推廣應(yīng)用。
張立科等介紹了在0～450µg/mL線性范圍內(nèi)，以cu2 作催化劑，以溶解氧將還原型維生素C氧化為在246.0 nm處無吸收的氧化型Vc，實(shí)現(xiàn)了樣品各紫外干擾成分的本底校正，建立了種測(cè)定果蔬Vc的新方法。該方法中維生素C破壞條件的選擇尤為重要，確定條件為：Cu用量為30 g，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為20min，加熱條件下，反應(yīng)速度快，無需加掩蔽劑。方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，測(cè)定了香蕉、西紅柿等果蔬中的VC含量，結(jié)果令人滿意。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)得出該方法RsD在0.32%～0.89%之間，實(shí)際測(cè)定了香蕉、西紅柿等樣品中的VC的含量，檢出限為0.2791g/mL，加標(biāo)回收率在97.16%～100.18%之間 。
3高效液相色譜法
前面介紹的方法由于在使用中有一定的限制，操作復(fù)雜、前處理較麻煩。因此在使用中有較大的局限性，目的已逐漸被高效液相色譜法所取代。HPLC法具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠等特點(diǎn)。
王艷穎，姜國斌等采用HYPERSIL-C8fz譜柱、濃度0.1%的草酸作流動(dòng)相的高效液相色譜法，分析了草莓中的維生素c含量，取得了理想的效果。HPLC檢測(cè)條件如下：
流動(dòng)相0.1%草酸溶液，流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣量5µL，柱箱溫度3O℃。該方法分析中受樣品中其他雜質(zhì)的影響較小。測(cè)定草莓中維生素C的含量，回收率為97.4%～102.1%，說明該方法具有所需試劑少、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，說明該方法重復(fù)性和再現(xiàn)性都是比較高的。
陳昌云等采用0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液：甲醇=80:20(v/v)作流動(dòng)相。流速為1.0 mL/min，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長為254 nm。測(cè)定蜜柚中維生素C含量在質(zhì)量濃度為20～100mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，方法回收率為92.4%～107.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。
4 結(jié)語
測(cè)定維生素C含量方法很多，各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，因?yàn)榫S生素C自身的不穩(wěn)定，導(dǎo)致了很多方法測(cè)定結(jié)果誤差較大，所以對(duì)維生素C穩(wěn)定存在條件的探索非常重要。高效液相色譜法因?yàn)闇y(cè)定較準(zhǔn)確、靈敏度高、選擇性好，有較好的發(fā)展前景，是目前發(fā)展較快的一種方法。
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