反相高效液相色譜法測定化妝品中的24種防腐劑
點擊: 次 時間:2017-04-05 10:43
建立了同時檢測化妝品中24種防腐劑含量的反相高效液相色譜法(RP2HPLC)。采用KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,以磷酸鹽緩沖溶液(pH=4.26)為流動相,梯度洗脫。樣品經(jīng)甲醇超聲提取,然后采用RP2HPLC2二極管陣列檢測法測定,對樣品前處理和色譜條件進(jìn)行研究和優(yōu)化。方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～3.3%;回收率為90.6%～97.8%;各種防腐劑的線性相關(guān)系數(shù)≥0.9997,具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,可用于化妝品中24種防腐劑含量的分析。
關(guān)鍵詞:反相高效液相色譜,化妝品,防腐劑
1引言
化妝品中的防腐劑是為了使化妝品在生產(chǎn)、使用和保存過程中免受微生物污染的一類化妝品添加劑。但大多數(shù)防腐劑對人的皮膚會產(chǎn)生不同程度的刺激。因此,化妝品中防腐劑的用量必須以安全性作為前提。我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》對化妝品中防腐劑的使用濃度和范圍做了相關(guān)的規(guī)定。目前,國內(nèi)外對化妝品中防腐劑的測定一般多采用高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、膠束電動色譜法、毛細(xì)管電泳法和伏安法等,而同時測定的防腐劑一般僅為4～8種,最多可同時測定18種,采用的方法均為氣相色譜-質(zhì)譜法。
本實驗研究了化妝品中的24種常用防腐劑的樣品前處理方法和HPLC分離條件,建立了化妝品中24種常用防腐劑同時檢測的HPLC法。結(jié)果表明,本方法簡便、快速、準(zhǔn)確,應(yīng)用于實際化妝品中防腐劑的測定,結(jié)果滿意。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
高效液相色譜儀,由四元低壓泵、柱溫箱、二極管陣列檢測器及自動進(jìn)樣器組成。
對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、水楊酸、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班(Sigma公司);苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇(AcrosOrgnics公司);2,4-二氯-3,5-二甲酚、對羥基苯甲酸異丙酯、2-苯酚、4-氯-3,5-二甲酚、對羥基苯甲酸異丁酯及2-芐基-4-氯酚(東京化成工業(yè)株式會社);苯甲酸、山梨酸(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)。乙腈為色譜純,甲醇為優(yōu)級純;無水乙醇、四氫呋喃等試劑均為國產(chǎn)分析純;Millipore超純水。
2.2標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液和供試品溶液的制備
分別準(zhǔn)確稱取一定量的24種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶液定容,配制成2g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取一定體積的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確稱取化妝品0.2g(精確到0.001g)于50mL錐形瓶中,加入10mL甲醇,超聲提取30min,取部分溶液放入離心管中,在離心機(jī)上以5000r/min高速離心10min后,取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾,濾液供RP-HPLC檢測。
2.3色譜條件
色譜柱:伊利特KromasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:A.甲醇,B.0.025mol/LNaH2PO4溶液,pH4.26。線性梯度洗脫條件見表1。流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:程序可變波長掃描;進(jìn)樣量:10μL。
3結(jié)果與討論
3.1流動相的選擇
3.1.1緩沖溶液pH的選擇在24種防腐劑中,受pH影響的只有苯甲酸、山梨酸和水楊酸。因此,著重考察了不同pH值(2.5～5.5)對以上3種酸分離情況的影響。發(fā)現(xiàn)在pH4.26時,苯甲酸、山梨酸和水楊酸能與溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和對羥基苯甲酸甲酯達(dá)到很好的分離,峰形良好。
3.1.2NaH2PO4濃度的選擇在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液對分離的影響后,發(fā)現(xiàn)0.025mol/LNaH2PO4可達(dá)到較好的分離,且峰形良好。
3.2檢測波長的選擇
通過全波長掃描可得到24種物質(zhì)各自的吸收圖譜。綜合各物質(zhì)在不同波長下的響應(yīng)值和不同波長對基線的影響,最終確定采用程序可變波長進(jìn)行掃描,即根據(jù)不同組分的出峰順序,在不同時間段,分別用各組分的最佳吸收波長進(jìn)行檢測,從而提高檢測的靈敏度,達(dá)到最佳的掃描效果。
3.3樣品提取方法的選擇
3.3.1樣品提取溶劑的選擇在相同的色譜條件下,比較了甲醇、乙醇、四氫呋喃和流動相等4種溶劑對不同種類化妝品(膏霜類、水類、固體類)的提取效果。結(jié)果表明,乙醇和四氫呋喃提取后的色譜圖在2.0～4.5min的色譜峰的峰形欠佳,無法準(zhǔn)確計算溴硝丙醇和水楊酸的含量,而流動相提取口紅時,不能將口紅完全溶解,且在28.26min時基線干擾較大,影響被測物質(zhì)含量的測定。從提取結(jié)果可看出,乙醇、四氫呋喃和流動相對某些物質(zhì)的提取率偏低,而甲醇對各物質(zhì)的提取率都較高,提取效果最佳,因此選擇甲醇作為樣品超聲提取的溶劑。
3.3.2超聲波提取時間的選擇研究了10～60min不同時間段內(nèi),超聲波的提取率。發(fā)現(xiàn)30min以上對提取率沒有明顯增大,且隨著超聲時間的延長,會使超聲波儀器內(nèi)的水溫上升,導(dǎo)致某些易揮發(fā)的成分揮發(fā),反而降低了提取率。所以,綜合考慮,選擇30min為超聲提取時間。圖1是24種防腐劑在確定的色譜條件下的液相色譜圖。
3.4線性關(guān)系、檢出限、回收率和精密度
在確定的最佳分離色譜條件下,配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜測定,以各組分的峰面積(Y)對濃度X(mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)信噪比(S/N)為3時,測得各防腐劑組分的檢出限。各組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限。
稱取3種經(jīng)測定含防腐劑較少,且基線干擾較小的化妝品0.2g(精確到0.001g),分別添加高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每種樣品重復(fù)6次,按上述實驗條件進(jìn)行樣品處理和測定,計算回收率和精密度。
3.5實際樣品分析
用所建立的檢測方法,對膏霜類、水類和固體類等9個實際化妝品樣品進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中各防腐劑的保留時間對化妝品中的防腐劑進(jìn)行定性,以樣品中各防腐劑色譜峰的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對應(yīng)進(jìn)行定量分析。表4僅列出了9個化妝品中檢測出的9種防腐劑的結(jié)果(其余15種防腐劑均未檢出)。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),大多數(shù)化妝品中都含有對羥基苯甲酸酯類和苯氧基乙醇,其它種類的防腐劑較少。其中以對羥基苯甲酸甲酯最常見,含量也較高。
綜上所述,采用超聲波提取,高效液相色譜分析,程序可變波長檢測,同時測定化妝品中24種常用防腐劑含量的方法,操作簡便,結(jié)果可靠。用于化妝品質(zhì)量控制,及進(jìn)出口化妝品檢驗具有重要意義。
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1引言
化妝品中的防腐劑是為了使化妝品在生產(chǎn)、使用和保存過程中免受微生物污染的一類化妝品添加劑。但大多數(shù)防腐劑對人的皮膚會產(chǎn)生不同程度的刺激。因此,化妝品中防腐劑的用量必須以安全性作為前提。我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》對化妝品中防腐劑的使用濃度和范圍做了相關(guān)的規(guī)定。目前,國內(nèi)外對化妝品中防腐劑的測定一般多采用高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、膠束電動色譜法、毛細(xì)管電泳法和伏安法等,而同時測定的防腐劑一般僅為4～8種,最多可同時測定18種,采用的方法均為氣相色譜-質(zhì)譜法。
本實驗研究了化妝品中的24種常用防腐劑的樣品前處理方法和HPLC分離條件,建立了化妝品中24種常用防腐劑同時檢測的HPLC法。結(jié)果表明,本方法簡便、快速、準(zhǔn)確,應(yīng)用于實際化妝品中防腐劑的測定,結(jié)果滿意。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
高效液相色譜儀,由四元低壓泵、柱溫箱、二極管陣列檢測器及自動進(jìn)樣器組成。
對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、水楊酸、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班(Sigma公司);苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇(AcrosOrgnics公司);2,4-二氯-3,5-二甲酚、對羥基苯甲酸異丙酯、2-苯酚、4-氯-3,5-二甲酚、對羥基苯甲酸異丁酯及2-芐基-4-氯酚(東京化成工業(yè)株式會社);苯甲酸、山梨酸(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)。乙腈為色譜純,甲醇為優(yōu)級純;無水乙醇、四氫呋喃等試劑均為國產(chǎn)分析純;Millipore超純水。
2.2標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液和供試品溶液的制備
分別準(zhǔn)確稱取一定量的24種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶液定容,配制成2g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取一定體積的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確稱取化妝品0.2g(精確到0.001g)于50mL錐形瓶中,加入10mL甲醇,超聲提取30min,取部分溶液放入離心管中,在離心機(jī)上以5000r/min高速離心10min后,取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾,濾液供RP-HPLC檢測。
2.3色譜條件
色譜柱:伊利特KromasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:A.甲醇,B.0.025mol/LNaH2PO4溶液,pH4.26。線性梯度洗脫條件見表1。流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:程序可變波長掃描;進(jìn)樣量:10μL。
3結(jié)果與討論
3.1流動相的選擇
3.1.1緩沖溶液pH的選擇在24種防腐劑中,受pH影響的只有苯甲酸、山梨酸和水楊酸。因此,著重考察了不同pH值(2.5～5.5)對以上3種酸分離情況的影響。發(fā)現(xiàn)在pH4.26時,苯甲酸、山梨酸和水楊酸能與溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和對羥基苯甲酸甲酯達(dá)到很好的分離,峰形良好。
3.1.2NaH2PO4濃度的選擇在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液對分離的影響后,發(fā)現(xiàn)0.025mol/LNaH2PO4可達(dá)到較好的分離,且峰形良好。
3.2檢測波長的選擇
通過全波長掃描可得到24種物質(zhì)各自的吸收圖譜。綜合各物質(zhì)在不同波長下的響應(yīng)值和不同波長對基線的影響,最終確定采用程序可變波長進(jìn)行掃描,即根據(jù)不同組分的出峰順序,在不同時間段,分別用各組分的最佳吸收波長進(jìn)行檢測,從而提高檢測的靈敏度,達(dá)到最佳的掃描效果。
3.3樣品提取方法的選擇
3.3.1樣品提取溶劑的選擇在相同的色譜條件下,比較了甲醇、乙醇、四氫呋喃和流動相等4種溶劑對不同種類化妝品(膏霜類、水類、固體類)的提取效果。結(jié)果表明,乙醇和四氫呋喃提取后的色譜圖在2.0～4.5min的色譜峰的峰形欠佳,無法準(zhǔn)確計算溴硝丙醇和水楊酸的含量,而流動相提取口紅時,不能將口紅完全溶解,且在28.26min時基線干擾較大,影響被測物質(zhì)含量的測定。從提取結(jié)果可看出,乙醇、四氫呋喃和流動相對某些物質(zhì)的提取率偏低,而甲醇對各物質(zhì)的提取率都較高,提取效果最佳,因此選擇甲醇作為樣品超聲提取的溶劑。
3.3.2超聲波提取時間的選擇研究了10～60min不同時間段內(nèi),超聲波的提取率。發(fā)現(xiàn)30min以上對提取率沒有明顯增大,且隨著超聲時間的延長,會使超聲波儀器內(nèi)的水溫上升,導(dǎo)致某些易揮發(fā)的成分揮發(fā),反而降低了提取率。所以,綜合考慮,選擇30min為超聲提取時間。圖1是24種防腐劑在確定的色譜條件下的液相色譜圖。
3.4線性關(guān)系、檢出限、回收率和精密度
在確定的最佳分離色譜條件下,配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜測定,以各組分的峰面積(Y)對濃度X(mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)信噪比(S/N)為3時,測得各防腐劑組分的檢出限。各組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限。
稱取3種經(jīng)測定含防腐劑較少,且基線干擾較小的化妝品0.2g(精確到0.001g),分別添加高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每種樣品重復(fù)6次,按上述實驗條件進(jìn)行樣品處理和測定,計算回收率和精密度。
3.5實際樣品分析
用所建立的檢測方法,對膏霜類、水類和固體類等9個實際化妝品樣品進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中各防腐劑的保留時間對化妝品中的防腐劑進(jìn)行定性,以樣品中各防腐劑色譜峰的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對應(yīng)進(jìn)行定量分析。表4僅列出了9個化妝品中檢測出的9種防腐劑的結(jié)果(其余15種防腐劑均未檢出)。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),大多數(shù)化妝品中都含有對羥基苯甲酸酯類和苯氧基乙醇,其它種類的防腐劑較少。其中以對羥基苯甲酸甲酯最常見,含量也較高。
綜上所述,采用超聲波提取,高效液相色譜分析,程序可變波長檢測,同時測定化妝品中24種常用防腐劑含量的方法,操作簡便,結(jié)果可靠。用于化妝品質(zhì)量控制,及進(jìn)出口化妝品檢驗具有重要意義。
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